VENTORES DE LA TERAPIA GENICA

VECTORES

Los vectores virales agrupan cuatro tipos de virus: retrovírus, adenovirus, virus adnoasociados y herpesvirus; existen también vectores no virales, como el bombardeo con partículas, la inyección directa de ADN, los liposomas catiónicos y la transferencia de genes mediante receptores.

VECTORES VIRALES

Los retrovirus comprenden una clase de virus cuyo material genético es una cadena sencilla de ARN; durante su ciclo vital, el virus se transcribe en una molécula bicatenaria de ADN, gracias a la acción de la enzima reverso transcriptasa, que se integra en el genoma de la célula huésped sin aparente daño para ella. La mayor parte de los retrovírus a excepción del HIV, sólo se pueden integrar en células con capacidad para replicarse, lo cual restringe su uso. Sin embargo, se pueden desarrollar en grandes cantidades y su expresión en la célula hospedadora se realiza durante largos periodos de tiempo. Los adenovirus son un conjunto de virus con ADN lineal de cadena doble. Los vectores de adenovirus son más grandes y complejos que los retrovirus, pues en su construcción solamente se elimina una pequeña región del material genético vírico. Su ciclo de infección, que comprende de 32 a 36 horas en un cultivo celular conlleva en primer lugar la síntesis de ADN de la célula y, posteriormente la sintesis y ensamblaje del ADN y las proteínas víricas. Las infecciones de estos virus en seres humanos están asociadas a enfermedades benignas, como la conjuntivitis.

La Principal ventaja de su utilización en la terapia génica es que se pueden producir en grandes cantidades y transfieren de forma muy eficaz el material genético a un número elevado de células y tejidos, aunque el hospedador parece limitar la duración de la expresión del nuevo material genético. Los virus adenoasociados son muy pequeño no autónomos y con ADN lineal de cadena sencilla. Para la replicación de estos virus es necesaria la confección con adenovirus. La inserción del material genetico de los adenovírus asociados se suele producir en regiones del cromosoma 19. Los vectores que se forman con este tipo de virus son muy simples, no pueden exceder en mucho la longitud del ADN viral, aproximadamente 4.680 nucleótidos, y son capaces de expresarse a largo plazo en las células que no se dividen; sin embargo, la respuesta que producen en la célula hospedadora es menor que la que se ocasiona con el tratamiento con adenovirus y es difícil la producción de este vector en grandes cantidades. Los herpesvirus poseen un material genético compuesto por ADN de doble cadena lineal, con un tamaño aproximado de 100 a 250 Kb.

Presentan variaciones en cuanto al tamaño y organización del genoma, contenido genético o células sobre las que actúan. Pero por regla general, este tipo de de virus son muy útiles, pues es posible insertar en su genoma grandes cantidades de ADN extraño y llevar a cabo durante largos periodos de tiempo infecciones latentes en la célula hospedadora, sin ningún efecto aparente sobre ésta. En la clase de los gamma-herpesvirus como el virus de Epstein-Barr, se pueden producir infecciones latentes en células en división, de modo que el material genético que lleva insertado el virus se replica conjuntamente a la división celular y se hereda en toda la nueva progenie de células. El inconveniente que presentan estos virus es que están asociados a daños linfoproliferativos, con lo cual, para su uso como vectores es necesario identificar estos genes y eliminarlos, manteniendo únicamente aquellos que permitan la replicación del virus y el mantenimiento del plásmido viral. Hasta la fecha, el uso fundamental de los herpesvirus en la terapia génica se limita al empleo in vivo del herpes simples (HSV)

- Retrovirus

Son virus ARN que tienen capacidad para integrar genes terapéuticos relativamente grandes (un máximo de 8 Kb). Necesitan de células empaquetadoras para su obtención. Se transfiere el DNA del virus mediante la técnica del fosfato de calcio a las células empaquetadoras. Posteriormente se realiza una segunda transducción en la cual introducimos la construcción génica de interés.

Los virus inyectados en el huésped integran su DNA en el genoma del huésped expresando así el gen que le hemos añadido. Como las proteínas del virus no son expresadas por el huésped, no tenemos una respuesta inmunitaria. Tienen una alta eficacia de transducción y también de expresión, siendo un sistema bien estudiado.

Sin embargo, únicamente sirven para infectar células del huésped que se encuentran en división. Además los títulos de virus obtenidos hasta ahora son bajos y la integración en el genoma es al azar.

Existen también vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma es más complejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto. Son los denominados lentivirus.

- Adenovirus

Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 Kb. de DNA exógeno. Normalmente en terapia génica se utiliza el serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos diferentes que infectan a humanos.

En este caso no se necesita la integración del material hereditario del virus en el del huésped para su replicación, por lo tanto tampoco el transgén será introducido en el genoma de la célula. Y por tanto tampoco necesitan que las células infectadas estén dividiéndose para su replicación.

La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta eficacia de transducción, al igual que la expresión de la construcción génica introducida, sin embargo ésta es transitoria (pocas semanas). Esto último obligaría a tratamientos periódicos lo cual es un inconveniente ya que los adenovirus producen respuesta inmune celular e inflamatoria.

- Virus adenoasociados (VAA)

Son parvovirus, contienen DNA como material genético, y requieren la coinfección con un adenovirus para multiplicarse. Son vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. Su capacidad de integrar DNA exógeno es pequeña, sólo de 5 Kb.

Las principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su DNA en la célula durante la replicación, por lo que la transducción (la cual es altamente eficaz) es estable en la célula diana. Además pueden infectar tanto a células en división como a las que no lo están (de gran importancia para la terapia génica "in vivo"). Los vectores AAV no están implicados en ningún tipo de enfermedad humana. Además el riesgo de una respuesta inmune está minimizado ya que no produce proteínas víricas.

Sin embargo existen también una serie de inconvenientes como que este tipo de vectores todavía no ha sido tan bien estudiado como los retrovirus y los adenovirus.

- Herpesvirus

Son virus DNA cuyas células diana son las neuronas. Su complejidad y lo poco que todavía conocemos de esta familia de virus dificulta su utilización.

La gran ventaja es el gran tamaño de su DNA , que les permite aceptar varios genes terapéuticos, incluso podrían ir con sus propias regiones reguladoras.

Uno de los inconvenientes es que habría que eliminar las secuencias que codifican para las proteínas líticas del virus que causan la muerte de las células a las que infectan.

Como resumen de los vectores, podemos hacer una recopilación de las características que deberían presentar para obtener el vector ideal para su uso en terapia génica:
- Permitir la incorporación y expresión regulada durante el tiempo conveniente, de uno o más genes necesarios para la aplicación clínica requerida
- Ser específico en su transferencia génica
- Ser irreconocible para el sistema inmune y no inducir respuesta inflamatoria
- Ser estable y fácil de obtener

VECTORES NO VIRALES

El bombardeo de partículas constituye una técnica efectiva de transferir genes tanto in vitro como in vivo. En este método físico el plásmido o porción de ADN es recubierto en su superficie por gotas de oro o tungsteno, de 1 a 3 micras de diámetro. Estas partículas, aceleradas por una descarga eléctrica de un aparato o por un pulso de gas son «disparadas» hacia el tejido. El éxito de esta técnica puede estar asegurado en los procesos de vacunación. Otra alternativa es la inyección directa del ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente, dentro del tejido deseado. Este método económico, y un procedimiento no tóxico, si se compara con la entrega mediante virus. Como desventaja fundamental hay que señalar que los niveles y persistencia de la expresión de genes dura un corto periodo de tiempo. Esta tecnologia puede tener potencial como un procedimiento de vacunación y como e genes a un nivel bajo. Los liposomas catiónicos consisten en la mezcla de un 1 lipido catiónico de carga positiva y varias moléculas de ADN con carga negativa debido a los fosfatos de la doble hélice. Este tipo de vectores se han usado en el tratamiento de la fibrosis sistica y en las enfermedades vasculares. Se pueden realizar transferencias de estos vía catéter, aunque su uso es limitado, dedido a la baja eficacia de transfección del material genético contenido en este complejo a la célula hospedadora ya su relativa toxicidad. Un problema que se plantea con las técnicas anteriores es que el vector alcance realmente su objetivo y no quede diseminado por el organismo. Por ello existe un procedimiento que consiste en introducir, junto al material genético que queremos transferir, moléculas que puedan ser reconocidas por los receptores de la célula diana. Estas moléculas pueden ser azucares, péptidos, hormonas, etc. y su ventaja respecto a otros modelos es que se establece una interacción muy específica, como la interacción transportador/célula, y no muy inespecífica como la que se verifica entre las cargas iónicas.

A) Liposomas

En 1965 se descubrió que los liposomas (bolsas rodeadas de una membrana lipídica a semejanza de una célula eucariota animal) eran capaces de hacer entrar DNA en la célula, pero hasta 1980 no se consiguió una eficacia de transfección adecuada. Existen dos tipos de liposomas: liposomas catiónicos y liposomas aniónicos.

B) Liposomas catiónicos

Se encuentran cargados positivamente por lo que interaccionan con la carga negativa del DNA. Existen muchos lípidos que se usan para formar estos liposomas e incluso se están probando mezclas de estos. Son recomendables en transfecciones "in vitro".

Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradación al transgén hasta su llegada al núcleo. La talla del DNA introducido en ellos no tiene límite. Podemos hacerlos llegar a tejidos específicos incluyendo receptores en la capa lipídica.
Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de transfección, una expresión transitoria, cierto grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes séricos.

C) Biolística o Gene-gun

Consiste en el bombardeo de los tejidos con partículas de oro o tungsteno que llevan adheridas a ellas el DNA. El bombardeo se realiza mediante una descarga con helio como si fuera una pistola (de allí el nombre de la técnica).

La capacidad de penetración es limitada usándose en líneas celulares, epidermis, músculo e hígado. Su expresión es transitoria y en la zona de descarga se produce una gran muerte celular. Esta técnica puede realizarse "ex vivo" (en el caso de células animales) e "in vivo" (en el caso de células vegetales).

APLICACION DE LA TERAPIA GENICA

APLICACION DE LA TERAPIA GENICA

En Animales

El primer ejemplo de terapia génica en mamíferos fue la corrección de la deficiencia en la producción de la hormona de crecimiento en ratones. La mutación recesiva little (lit) produce ratones enanos. A pesar de que estos presentan un gen de la hormona del crecimiento aparentemente normal, no producen mRNA a partir de este gen.

El primer paso en la corrección del defecto consistió en la inyección en huevos lit/lit de unas 5 mil copias de un fragmento de DNA lineal de 5 Kb portador de la región estructural del gen de la hormona del crecimiento de la rata fusionado al promotor del gen de la metalotioneína de ratón (MP). La función normal de la metalotioneína es la destoxificación de los metales pesados, por lo que la región reguladora responde a la presencia de metales pesados en el animal. Los huevos inyectados se implantaron en hembras pseudopreñadas y se analizo la descendencia.

Aprox. el 1% de los ratones recién nacidos resultaron ser transgénicos, y aquellos a los que se les administraron metales pesados durante el desarrollo alcanzaron mayor tamaño.

En los mamíferos, el sitio de inserción del DNA introducido es muy variable y no suele encontrarse integrado en el locus homologo. Por ello, la terapia génica en la mayoría de los casos no implica una corrección genuina del problema original sino más bien un enmascaramiento del mismo.

Se ha generado una tecnología similar para generar variedades transgénicas de salmón del Pacifico con una tasa rápida de crecimiento y los resultados han sido espectaculares. Se microinyectó en huevos de salmón un plasmado portador del gen de la hormona del crecimiento regulado por el promotor de la metalotioneína (ambos derivados del salmón).

Una pequeña porción de los peces resultantes fue transgénica, a juzgar por los resultados positivos obtenidos por el escrutinio del DNA utilizando el plasmado como sonda. Estos peces por termino medio pesaron 11 veces más que los controles no transgénicos.

En humanos

Quizás, la aplicación más excitante y polémica de la tecnología de los transgenes es la que respecta a la terapia génica humana, es decir, el tratamiento y alivio de las enfermedades genéticas humanas mediante la adición de genes silvestres exógenos para corregir la función defectuosa de las mutaciones.

En los seres humanos puede utilizarse dos tipos básicos de terapia génica, la somatica y la germinal.

APLICACIONES Y ENFERMEDADES

APLICACIONES DE LA TERAPÌA GENICA

• Marcaje génico: El marcaje génico tiene como objetivo, no la curación del paciente, sino hacer un seguimiento de las células, es decir, comprobar si en un determinado sitio del cuerpo están presentas las células específicas que se han marcado. Un ejemplo de ello sería la puesta a punto de vectores para ensayos clínicos, permitiendo, por ejemplo, que en ocasiones en las que un paciente de cáncer (leucemia) callampa y al que se le ha realizado un autotrasnplante recae se pueda saber de donde proceden las células, si son de células transplantadas o si son células que han sobrevivido al tratamiento.

• Terapia de enfermedades monogénicas hereditarias: Se usa en aquellas enfermedades en las que no se puede realizar o no es eficiente la administración de la proteína deficitaria. Se proporciona el gen defectivo o ausente.

• Terapia de enfermedades adquiridas: Entre este tipo de enfermedades la más destacada es el cáncer. Se usan distintas estrategias, como la inserción de determinados genes suicidas en las células tumorales o la inserción de antígenos tumorales para potenciar la respuesta inmune.

ENFERMEDADES DE LA TERAPIA GENICA

Son numerosas las enfermedades objeto de la terapia génica, siendo las más características las tratadas a continuación:

ADA

El primer protocolo clínico aprobado por la FDA para el uso de la terapia génica fue el utilizado en el tratamiento de la deficiencia en adenosín deaminasa (ADA) que provoca un trastorno de la inmunidad, en 1990. En estos pacientes no se ha podido retirar el tratamiento enzimático exógeno necesario para su supervivencia, sino sólo disminuirlo a la mitad y se ha detectado la persistencia en la expresión del gen aún después de cuatro años de iniciado el protocolo. Aunque no se haya logrado la completa curación de los pacientes (que consistiría en retirar todo el aporte enzimático exógeno) este constituye un hecho inédito en la historia terapéutica. En 2009 se hace un nuevo experimento en el que extraen células hematopoyéticas de la médula ósea para la introducción del gen ADA ex vivo mediante un retrovirus modificado (GIADA). Las células modificadas se vuelven a introducir en el paciente. Los resultados de este experimento fueron exitosos porque ninguno de los pacientes desarrollo leucemia (como si había ocurrido con el empleo de retrovirus). Además, todos los pacientes desarrollaron una expresión correcta del gen ADA durante los años de seguimiento que se les hizo y consiguieron un aumento de células sanguíneas. De esta manera 8 de los nueve pacientes no necesita tratamiento enzimático exógeno para complementar la terapia génica.

Cancer

El tratamiento del cáncer hasta el momento ha implicado la destrucción de las células cancerosas con agentes quimioterapeúticos, radiación o cirugía. Sin embargo, la terapia génica es otra estrategia que en algunos casos ha logrado que el tamaño de tumores sólidos disminuya en un porcentaje significativo. Los principales métodos que utiliza la terapia génica en el cáncer son:

1. Aumento de la respuesta inmune celular antitumoral (terapia inmunogénica). Está basada en la habilidad del sistema inmune atacar contra el cáncer.
2. Introducción de genes activadores de drogas dentro de las células tumorales o terapia de genes suicidas. Consiste en la introducción selectiva de genes que codifican para la susceptibilidad a drogas que de otra manera no serían tóxicas. Esto lleva a la producción de enzimas (como por ejemplo la HSV-tk [Herpex simplex virus timidina kinasa]), que es una enzima inofensiva para las células de mamíferos, convierten prodrogas (vg ganciclovir, 5-fluorocitocina) en metabolitos citotóxicos que destruyen a las células tumorales en proliferación.
3. Normalización del ciclo celular. Consiste en la inactivación de oncogenes mutados, como el ras, o en la reexpresión de antioncogenes o genes supresores de tumor inactivos como el p53.
4. Manipulación de las células de la médula ósea. Es utilizada principalmente en la terapia génica de desórdenes hematológicos, y consiste en transferir a las células progenitoras hematopoyéticas genes de quimioprotección o de quimiosensibilización, entre otros.
5. Uso de ribozimas y tecnología antisentido o "antisense". Las ribozimas son ARN con actividad catalítica que actuarían incrementando la degradación del ARN recién traducido, disminuyendo proteínas específicas no deseadas, factor que a veces se asocia a alteraciones tumorales. La tecnología antisentido se refiere a oligonucleótidos de ARN que no tienen actividad catalítica, sino que son complementarios a una secuencia génica y que pueden actuar bloqueando el procesamiento del RNA, impidiendo el transporte del mRNA o bloqueando el inicio de la traducción.

Síndrome de Wiskott-Aldrich(WAS)

El síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X caracterizada por eczema, trombocitopenia, infecciones recurrentes, inmunodeficiencia así como una gran tendencia a los linfomas y a las enfermedades autoinmunes. También hay una versión más suave de esta enfermedad conocida como trombocitopenia ligada al cromosoma X o XLT caracterizada por microtrombocitopenia congénita con plaquetas de pequeño tamaño. Ambas enfermedades están producidas por mutaciones en el gen WAS que codifica para una proteína multidominio que sólo se expresa en células hematopoyéticas, WASP. Por lo tanto, la mayoría de los que padecen este síndrome sufren una muerte prematura debido a una infección, hemorragia, cáncer o anemia grave autoinmune. Actualmente, se han realizado tratamientos eficaces en pacientes con el síndrome de Wiskott-Aldrich por medio de trasplantes de médula ósea o sangre del cordón umbilical de un donante HLA idéntico o compatible. En 2010 se publica un estudio que muestra importante mejoras en dos niños diagnosticados con la enfermedad. La terapia consistió en extraer las células madre hematopoyéticas y volvérselas a trasferir tras integrarles el gen WAS en el genoma. Tras la terapia génica, detectaron niveles significativos de la proteína WASP en las diferentes células del sistema inmune de los pacientes. El resultado fue que los pacientes tuvieron varias mejoras significativas: uno de ellos se recuperó por completo de la anemia autoinmune y el otro paciente redujo el eczema que sufría.

Beta Talasemia

La β-talasemia constituye un desorden genético con mutaciones en el gen de la β-globulina que reduce o bloquea la producción de esta proteína. Los pacientes con esta enfermedad padecen anemia severa y requieren trasfusiones de sangre a lo largo de toda su vida. La terapia génica tiene como objetivo sanar las células madre de la médula ósea mediante la transferencia de la β-globina normal o gen de β-globina en células madre hematopoyéticas (CMH) para producir de forma permanente los glóbulos rojos normales. Para llevarlo a cabo se pretende emplear lentivirus porque varios estudios muestran la corrección de la β-talasemia en modelos animales. Los objetivos de la terapia génica con esta enfermedad son: optimizar la transferencia de genes, la introducción de una gran cantidad de CMH modificadas genéticamente y reducir al mínimo las consecuencias negativas que pueden derivarse de la integración al azar de los vectores en el genoma.

Hemofilia

La TG está resultando también eficaz en casos de hemofilia «A» y «B» donde se encuentran alterados los factores coagulantes VIII y IX, respectivamente. En ellas se han realizado aproximaciones utilizando el transgén de estos factores y vectores retroviales, adenovirus, virus adenoasociados y ADN desnudo administrados por vías comunes como la subcutánea, intramuscular, intrahepática, intraperitoneal, o intravenosa.


Los vectores actúan como un liberador de los factores a las células musculares del paciente, donde producirán continuamente este factor. Valores equilibrados de éstos en el flujo sanguíneo reducirán sustancialmente los episodios de hemorragias espontáneas y la necesaria infusión de estas proteínas en los pacientes de este tipo de hemofilia.

Fibrosis quística

En la fibrosis quística se ha observado un defecto en el gen que codifica para el canal de cloro conocido como CFTR, que resulta en un transporte anormal de electrólitos en las glándulas exocrinas y conduce a una enfermedad crónica obstructora de los pulmones, insuficiencia pancreática exocrina y aunento de la cantidad de electrólitos en el sudor. Utilizando como transgén el gen de CFTR y las células del epitelio del tracto respiratorio, se han realizado estudios utilizando liposomas y adenovirus como vectores. Los riesgos de toxicidad parecen descartados en los primeros intentos y basta algo tan sencillo como un inhalador para conseguir la expresión del gen y aliviar en un 30% los síntomas de la enfermedad.

Distrofia muscular Duchenne

En un avance significativo hacia un tratamiento para la distrofia muscular de Duchenne (DMD), investigadores han usado TG para proteger músculos respiratorios vitales en ratones con la enfermedad, debido a que la mayor causa de muerte en la DMD es el deterioro del diafragma. La nueva investigación ha demostrado por primera vez cómo el diafragma puede ser rescatado por medio de la inyección intravenosa con el gen de la distrofina, que es defectuoso en las personas con DMD. Después del tratamiento, el músculo del diafragma del ratón mostró una expresión estable del gen de la distrofina durante seis meses.

Alteraciones hepáticas

A pesar de los problemas técnicos, existen protocolos clínicos aprobados para la transferencia ex vivo de genes al hígado, para el tratamiento de la insuficiencia hepática aguda e hipercolesterolemia familiar. Los experimentos con ratones transgénicos, bioquímica y fenotípicamente modificados han permitido evaluar la eficacia terapéutica de la transferencia génica somática de vectores adenovirales de la ornitina transcarbamilasa (OTC), beta-galactosidasa y alfa1-antitripsina humana. Una de las vías para restituir la funcionalidad del hígado cirrótico se enfoca en la degradación del exceso de acunulación de proteínas de la matriz extracelular, principalmente colágena tipo I en el parénquima hepático. La metaloproteasa de matriz-8 o colagenasa de neutrófilos de hunano es una buena candidata para ser sobre expresada. Otra aproximación, en hígados cirróticos, la constituye el gen del activador del plasminógeno urocinasa hunano modificado. Su inserción mediante un vector adenoviral induce la degradación del exceso de matriz extracelular y estimula la proliferación de hepatocitos, logrando un rápido restablecimiento de la funcionalidad del hígado.

Diabetes

La TG mantiene abiertas dos líneas de investigación en pacientes con diabetes tipo 1, caracterizada por una pérdida completa de las células betapancreáticas. Mientras la primera se basa en la modificación de la respuesta anómala del sistema inmunitario, la segunda intenta aumentar el número de células capaces de secretar insulina.


Entre las vías de actuación sobre la respuesta autoinmunitaria destacan:


– Inhibición de moléculas implicadas en el desarrollo de la diabetes tipo 1 como interleucina 1beta, factor de necrosis Tumoral alfa, interferón gamma, interleucina 6 y óxido nítrico.


– Estimular la expresión de interleucina 4 con el fin de prevenir el proceso de inflamación previo a la destrucción de las células beta.


– Inhibición de la interacción de moléculas Fas/Fas-L.

– Producción local, en células beta genéticamente modificadas, de moléculas anti-CD40-ligando, una proteína que desempeña un papel clave en la activación de los linfocitos T. Con el fin de aumentar el número de células beta, la TG ha centrado sus esfuerzos en generar células no-beta capaces de secretar insulina en respuesta a las concentraciones de glucosa. El tipo celular donde se han obtenido resultados más interesantes y que há generado mayores expectativas es el hepatocito. Los hepatocitos presentan la capacidad de captar la concentración extracelular de glucosa, ya que comparten con las células beta algunos de los componentes naturales del sistema de detección de glucosa, como la glucocinasa y GLUT-2. Los hepatocitos modificados son capaces de producir insulina con la actividad biológica y funcional similar a la de la molécula producida por el páncreas. No obstante, debido a que las células del hígado presentan diferente sensibilidad a la glucosa que el páncreas, las cinéticas (los ascensos y descensos) de producción de la insulina obtenida son muy diferentes a las de la insulina nativa producida por el páncreas, y el control de la glucosa en sangre no resulta óptimo.

La introducción del gen PDX-1, implicado en las primeras fases de formación y desarrollo del páncreas, y en el control de la expresión del gen de la insulina en células beta maduras, ha resultado suficiente para que el hígado de los ratones produzca insulina, lo que ha permitido un descenso de las concentraciones de glucosa de los animales a los que se les había inducido la diabetes mediante el agente químico estreptozotocina.

Enfermedades neurodegenerativas

Se han realizado también aproximaciones de TG en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en humanos. En cultivos primarios de neuronas piramidales de hipocampo de rata se ha sobre-expresado la proteína calbindina D28K, obteniéndose altos rendimientos. Esta proteína es capaz de unirse al ion calcio modulando sus concentraciones citoplasmáticas. La sobre-expresión de esta proteína confirió protección a los cultivos frente a estímulos citotóxicos como el fragmento 25-35 del péptido betaamiloide. También se há analizado a pacientes en las primeras etapas de la enfermedad, con la implantación de células cutáneas a las que previamente se les ha introducido el gen del factor de crecimiento neurológico (NGF) que ha mostrado resultados positivos en el deterioro cerebral en monos viejos.

Otras patologías como la enfermedad de Parkinson, en la que la relación con los factores genéticos es menos clara, representan un mayor desafío. En esta enfermedad, la TG ha sido llamada el «tercer paso», tras la terapia sustitutiva con la levodopa y los implantes de células dopaminérgicas. Así, las células hiperactivas del núcleo subtalámico son consideradas como células diana para la inserción del gen de la descarboxilasa glutámica ácida (GAD), responsable de la producción del neurotransmisor inhibitorio GABA, obteniéndose como resultado un funcionamiento más normal de la actividad de la red cerebral. También se han realizado aproximaciones de TG ex vivo, con trasplantes de células capaces de producir dopamina o de secretar factores de crecimiento o neurotrofinas (BDNF, GDNF) que actúan como agentes neurotróficos, activando rutas de supervivencia celular en las neuronas afectadas. Utilizando un virus de inmunodeficiencia felino sobre un modelo animal de una enfermedad lisosomal humana, la enfermedad de Sly, con déficit de enzima betaglucuronidasa que cursa con deterioro neurológico progresivo, presentó, por primera vez en este tipo de investigaciones, no sólo la prevención del progreso neurológico, sino también la restauración de las capacidades previas mentales de los animales.

Como último ejemplo de las enfermedades neurodegenerativas en las que se han llevado a cabo diversas aproximaciones de TG, citaremos las ataxias, en las que se ha utilizado como vector un VIH atenuado capaz de alcanzar los ganglios dorsales medulares, una de las áreas más afectadas en la ataxia de Friedreich. Se ha planteado el uso de moléculas, como el factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-I), que retrasen la muerte celular observada, planteándose la posibilidad de la regeneración neuronal mediante el uso de células madre.

Ceguera

Se han realizado estudios en un tipo de ceguera total, acompañada de degeneración de la retina, que se relaciona con mutaciones en el gen RPE95. En modelos experimentales, la administración directa en la retina de un virus portador del gen funcional es capaz de impedir la degeneración y permite que la actividad eléctrica de esta estructura ocular sea comparable a la que se observa en animales sanos. Los resultados de este estudio constituyen el primer éxito para prevenir la ceguera en un mamífero y tienen una importancia adicional, si consideramos que las mutaciones del gen RPE95 se observan en el humano en la ceguera congénita conocida como amaurosis de Leber. Por otro lado, la manipulación genética de células de la córnea ex vivo puede ser, en el futuro, una solución frente a la incompatibilidad y el rechazo observado en algunos trasplantes de córnea. Hasta ahora, los experimentos realizados en animales han sido un éxito.

Sida

Se han realizado aproximaciones, tanto in vivo como ex vivo, en el sida, mediante el empleo de vectores retrovirales portadores de genes de la cápside o la envoltura del VIH, como la glicoproteína 120, siendo los linfocitos T las células diana. Los glóbulos blancos modificados reconocen las células infectadas por el VIH y las eliminan, tanto en las primeras etapas de la infección como al cabo de largos tratamientos antivirales. En los primeros ensayos clínicos estas células pueden eliminarlo de manera tan eficaz como lo harían los linfocitos T atacados por el virus, es más, éstas son capaces de atacar eficazmente a varios mutantes del VIH.

Insuficiencia cardíaca

La TG viene a aumentar el abanico terapéutico disponible en la actualidad en la insuficiencia cardiaca, abriendo las puertas a un nuevo tratamiento que tiene como diana a la proteína fosfolamban. Individuos con insuficiencia cardiaca presentan alteraciones en la regulación de esta proteína. La sobre-expresión, mediante un virus adenoasociado, de una forma mutada del gen de la fosfolamban bloquea a la proteína nativa. En estos casos se utilizó un catéter, similar al utilizado en la actualidad para practicar angioplastias, para transportar el virus hasta el lugar de acción.

Arterosclerosis

Recientemente se ha abierto la posibilidad de aplicar la TG a patologías como la arteriosclerosis.

La administración, mediante catéteres espaciales, en la arteria poplítea de la extremidad afectada por mal riego sanguíneo de genes que expresaban el factor de crecimiento vascular endotelial, ha sido considerada un éxito parcial. Aunque los resultados iniciales no han sido del todo buenos (ya que tan «sólo» consiguieron evitar la amputación de la pierna gangrenada durante varias semanas), sí consiguieron revascularizar la extremidad.

Disfunción eréctil e infertilidad

La sobre-expresión de factores de crecimiento antes de una prostatectomía radical podría ayudar a reparar el nervio cavernoso y, de esta manera, se podría minimizar la disfunción eréctil neuropática y preservar la capacidad de erección. En ratas, la técnica alcanza tasas de éxito de entre el 70 y el 85%. Las técnicas de TG han sido también empleadas para revertir la infertilidad en ratones machos, que se convirtieron en fértiles sin que el gen o el vector lentiviral introducido se transmitiese a su descendencia. Los ratones tratados presentaban dificultad en la formación de células espermáticas debido a ciertas mutaciones en el gen KL2 de sus células de Sertoli.

Dolor

Por último, la TG ha realizado incursiones en el campo del dolor. Así, la expresión de forma continuada de preproencefalina en neuronas sensitivas abre las puertas a aplicaciones clínicas en el tratamiento del dolor asociado al cáncer, artritis, angina y neuropatías periféricas. La TG, al ser específica, permite que la liberación de sustancias analgésicas se produzca tan sólo en los lugares de la hiperestimulación, evitando la aparición de efectos secundarios de los narcóticos como la confusión mental y el letargo.

LIMITACIONES EN HUMANOS

LIMITACIONES DE LA TERAPIA GENICA EN HUMANOS

El primer objetivo de la identificación y clonación de genes responsables de enfermedades de origen genético es el diagnóstico precoz, prenatal o postnatal. Pero diagnósticos eficaces sin terapia posible satisfacen poco a los afectados. La identificación de genes humanos mediante técnicas de ingeniería genética constituye, no obstante, el primer paso para desentrañar las bases moleculares y fisiopatológicas de una enfermedad. Conocidas éstas, las estrategias de investigación pueden ir en dos direcciones:

<>

 

<>

 

1.

Vía farmacológica, para intentar compensar las consecuencias fisiológicas del disfuncionamiento celular;

2.

Vía genética, buscando la introducción de un gen foráneo -el transgén- en las células afectadas, para que sustituya al gen anómalo. Este enfoque es el que corresponde a la terapia génica. Desde los primeros intentos (no autorizados) de terapia génica por Martin Cline en 1979-1980 hasta hoy. Lo ideal sería colocarlo dentro de uno de los cromosomas de la célula diana, en sustitución del gen anómalo. Pero, de momento, el recurso a la técnica más eficaz está vedada en humanos. La recombinación homóloga se ha mostrado operativa en ratón, permitiendo una modificación estable y definitiva de las células embrionarias germinales, transmisible a la descendencia. Pero esta posibilidad en el hombre es rechazada unánimemente por todos los comités internacionales de bioética. Sólo queda el recurso a la adición génica: el gen defectuoso sigue presente en el cromosoma, y el transgén introducido puede permanecer fuera del núcleo o de los cromosomas en forma de ADN no cromosómico (episoma). Otra alternativa sería la introducción al azar del transgén en el genoma, con el riesgo de alterar la función de algún gen esencial. Las precauciones frente a estas estrategias tan imprecisas consisten en impedir la propagación y transmisión del sistema de transferencia del gen (el vector) y comprobar si la inserción del gen foráneo no conlleva la inactivación de algún gen del hospedador o la activación de algún proto-oncogén.

REQUISITOS Y CRITERIOS

REQUISITOS Y CRITERIOS PARA EL ESTUDIO DE LA TERAPIA GENICA

Evidentemente la meta de los estudios que involucran la terapia génica como alternativa terapéutica es la posibilidad de la utilización en la clínica.

Para ello se requiere cumplir una serie de requisitos que justifiquen estos medios y que a continuación se mencionan:

1. La patología no debe tener actualmente un tratamiento efectivo para su cura. Para llegar a una propuesta terapéutica sólida y científicamente viable, se requiere de una fuerte inversión en recursos humanos y económicos por un tiempo prolongado. Esto hace que el costo de una o varias líneas de investigación que conduzcan a la propuesta de alternativas terapéuticas para determinada patología sea elevada. La inversión de estos recursos debe ser justificada cuidadosamente y, por ello, es conveniente que la patología constituya un problema de salud pública que no cuente con cura actualmente.
2. Se debe conocer en lo posible los detalles del efecto involucrado a nivel molecular. Es evidente que si se pretende intervenir a nivel molecular, es indispensable contar con el conocimiento detallado del efecto, o los efectos.
3. Se debe tener un sustento científico sólido que justifique la intervención a nivel molecular. Para llegar a la aplicación clínica de la terapia génica, se debe contar con amplia y sólida evidencia científica que demuestre que la intervención a nivel molecular podría resultar en la mejoría de la salud el paciente, o en la resolución del problema en cuestión. Esto se hace evidente mediante la publicación de artículos científicos que forman el marco teórico que sustenta la intervención molecular. Los protocolos establecidos internacionalmente requieren de una secuencia lógica que incluye desde la comprobación de cambios celulares fenotípicos in vitro, generados por el ácido nucleico terapéutico en cuestión, así como la comprobación de los efectos terapéuticos en modelos animales, la caracterización toxicológica del procedimiento, hasta llegar finalmente a la propuesta de su aplicación en protocolos clínicos.

Normas para recibir terapia génica

Las normas para recibir terapia génica están bien establecidas e incluyen varios requisitos:

1. El gen debe estar aislado y debe estar disponible para la transferencia, normalmente por clonación.
2. Debe haber un medio efectivo para la transferencia del gen. Por el momento, muchos ensayos utilizan vectores retrovíricos, aunque también se emplean otros métodos, como los vectores adenovíricos y las técnicas físicas y químicas.
3. El tejido diana debe ser accesible para la transferencia genética. La primera generación de procesos de terapia génica utiliza glóbulos blancos o sus precursores como tejido diana.
4. No debe haber ninguna forma de terapia efectiva disponible, y la terapia génica no debe dañar al paciente.

Actualmente se están tratando varias enfermedades hereditarias con terapia génica, como la inmunodeficiencia combinada grave (SCDI, del ingles severe combined inmunodeficiency), la hipercolesterolemia familiar, la fibrosis quística y la distrofia muscular, y se están desarrollando procesos para tratar otras enfermedades.